Après les événements de Resident Evil: Apocalypse et l'accident de Raccoon City, la Umbrella Corporation, malgré la destruction à l'arme nucléaire de Raccoon City, découvre avec surprise que le virus-T, leur fameuse arme biologique qui a le pouvoir de réanimer les morts en zombies, est arrivé à s’échapper des ruines de Raccoon City. Umbrella  Corp. tente désespérément d'empêcher  la propagation du virus-T qui a transformé, continent après continent, le monde entier en ruine et l'humanité en zombie. Après la prolifération du virus T, l'humanité est au bord de l'extinction. Alice (Milla Jovovich), la fameuse "arme bio-organique" d'Umbrella qui est devenue une combattante libre, reste désormais seule dans les ruines désertiques ou de ce qui reste des États-Unis, essayant désespérément de trouver des survivants et de se protéger face aux hordes de zombies, avec ses pouvoirs psychiques et surhumains qu'elle a acquis lors de son emprisonnement chez Umbrella corp.

Désormais, Alice ne doit pas seulement se battre contre ces armées de zombies, mais contre la puissance d'Umbrella, qui tente en dernier recours  de créer un vaccin permanent contre le virus-T pour sauver ce qui reste de l'humanité. Mais Alice, s'échappe et se cache dans le désert du Nevada, près des ruines de Las Vegas. Elle est rejointe plus tard par certains survivants de la catastrophe de Raccoon City tel que Carlos Olivera (Oded Fehr) et L.J. (Mike Epps). Elle va également rencontrer de nouveaux survivants comme Claire Redfield (Ali Larter), K-Mart (Spencer Locke) et Nurse Betty (Ashanti).

ALICE  et ses pouvoirs

Un jour, durant son voyage, Alice retrouve un carnet dans le convoi des survivants, qui parle d'un endroit au nord, près de l'Alaska, où il n'y aurait pas d'infection. Croyant à toutes leurs chances de trouver un refuge là bas, Alice et ses équipiers essayeront de se rendre à ce fameux refuge, mais avant tout ils devront combattre encore et encore Umbrella Corporation, qui leur barre la route dès que possible pour capturer  Alice. Échouant dans sa capture, Umbrella, dont Albert Wesker est à la tête, a recourt à la création de clones d'Alice (à partir de l'ADN qu'ils ont pu extraire durant son emprisonnement), mais seulement une petite partie des clones et de leur sang est compatible avec ce que le Dr Isaacs a besoin pour créer le vaccin. Désormais, Isaacs ne s'intéresse plus à sauver l'humanité, mais plutôt à continuer ses recherches sur "l’être ultime", recherches qui avaient été abandonnées plusieurs années auparavant. Isaacs est capable de terminer ses recherches, mais quand Wesker les découvre, il ordonne le meurtre de Isaacs, mais ce dernier arrivera heureusement  à s'échapper à temps avant son exécution..